ISOLASI, KLONING DAN KARAKTERISASI GEN phbA, phbB, dan phbC YANG BERPERAN DALAM BIOSINTESIS POLY-(R)-3-HIDROKSIBUTIRAT
Total View This Week0

Institusion

Institut Teknologi Bandung

Author

Ode Sri Rizki, Wa (STUDENT ID : 20517034)
(LECTURER ID : 0001095802)
(LECTURER ID : 0023057301)

Subject

Kimia 

Datestamp

0000-00-00 00:00:00 

Abstract :
Peningkatan jumlah penduduk berbanding lurus dengan penggunaan plastik. Akumulasi limbah plastik dalam jumlah besar dapat menimbulkan pencemaran lingkungan karena sifatnya yang sulit terdegradasi. Salah satu upaya untuk menanggulangi limbah plastik ialah penggunaan plastik terbiodegradasi atau biasa disebut bioplastik. Poli-(R)-3-hidroksibutirat (PHB) merupakan salah satu bioplastik yang disintesis dan diakumulasi oleh bakteri secara intrasel sebagai cadangan energi. Jalur biosintesis PHB di dalam bakteri melibatkan 3 gen yaitu phbA (mengkode asetil-CoA-asetiltransferase), phbB (mengkode asetoasetil-CoA-reduktase), dan phbC (mengkode PHB sintase). Produksi PHB dari bakteri Halomonas elongata masih cukup rendah yaitu sekitar 20%. Oleh sebab itu, pada penelitian ini dilakukan isolasi dan kloning ketiga gen yang berperan dalam biosintesis PHB untuk meningkatkan produktivitas PHB. Penelitian ini diawali dengan uji kualitatif bakteri penghasil PHB. Halomonas elongata BK-AG25 memberikan hasil positif sebagai bakteri penghasil PHB. Gen phbA, phbB, dan phbC telah berhasil diamplifikasi dari genom Halomonas elongata BK-AG25 menggunakan masing-masing sepasang primer yang telah dirancang berdasarkan kemiripan urutan gen serupa dengan beberapa spesies halomonas. Amplikon phbA, phbB, dan phbC memiliki ukuran 1176 pb, 747 pb, dan 1832 pb. Ketiga fragmen DNA tersebut diklon ke vektor pGEM-T Easy dan ditransformasi ke E.coli TOP10. Koloni rekombinan dipilih berdasarkan seleksi putih-biru dan dianalisis berdasarkan PCR koloni, analisis ukuran plasmid, serta rePCR. Hasil analisis koloni rekombinan dikonfirmasi berdasarkan hasil penentuan urutan nukleotida. Fragmen phbA, phbB dan phbC disejajarkan menggunakan Seqman dan ditentukan urutannya menggunakan BLASTN. Urutan phbA, phbB, dan phbC memiliki kemiripan sebesar 97%, 98%, dan 99% dengan genom Halomonas elongata DSM 2581 (No.akses FN 869568.2). Urutan asam amino PhbA memiliki kemiripan sebesar 74% dengan asetil-CoA asetiltransferase (No.akses WP013333885.1). Urutan asam amino PhbB memiliki kemiripan sebesar 99% dengan asetoasetil-CoA reduktase (No.akses WP065241591.1). Sedangkan urutan asam amino PhbC memiliki kemiripan sebesar 99% dengan PHB sintase (No.akses WP013333150.1). Hasil analisis asam amino PhbA, PhbB, dan PhbC menggunakan ExPASy menunjukkan bahwa ketiga protein didominasi oleh asam amino nonpolar alifatik. Hasil analisis struktur sekunder PhbA, PhbB, dan PhbC menggunakan SAS (Sequence Annotated by Structure) menunjukkan bahwa ketiga protein didominasi oleh struktur coil/turn. Hasil analisis struktur tersier menggunakan SWISS Model dan I-TASSER menunjukkan bahwa PhbA, PhbB, dan PhbC memiliki pelipatan ?/?. Prediksi residu katalitik menunjukkan adanya Cys96, dan Ser360 untuk PhbA, Asn113, Ser141, Gln151, Tyr154, dan Lys158 untuk PhbB dan Cys330, Asp485, dan His513 untuk PhbC. Dapat disimpulkan bahwa gen phbA, phbB, dan phbC telah berhasil diklon ke vektor pGEM-T Easy.